RNA-Strukturen im Hepatitis-C-Virus und ihre Bedeutung für Translation und Replikation

Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein umhülltes Virus aus der Familie der Flaviviridae. Es besitzt ein Plusstrang-RNA Genom von ca. 9600 Nukleotiden Länge, das nur ein kodierendes Leseraster besitzt. Das Genom wird am 5’ und 3’ Ende von nicht-translatierten Sequenzen (NTRs) flankiert, welche für die Translation und vermutlich auch Replikation von Bedeutung sind. Die 5’ NTR besitzt eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES), die eine cap-unabhängige Translation des ca. 3000 Aminosäure langen viralen Polyproteins erlaubt. Dieses wird ko- und posttranslational von zellulären und viralen Proteasen in 10 funktionelle Komponenten gespalten. Inwieweit die 5’ NTR auch für die Replikation der HCV RNA benötigt wird, war zu Beginn der Arbeit nicht bekannt. Die 3’ NTR besitzt eine dreigeteilte Struktur, bestehend aus einer variablen Region, dem polyU/UC-Bereich und der sogenannten X-Sequenz, eine hochkonservierte 98 Nukleotide lange Region, die vermutlich für die RNA-Replikation und möglicherweise auch für die Translation benötigt wird. Die genuae Rolle der 3’ NTR für diese beiden Prozesse war zu Beginn der Arbeit jedoch nicht bekannt. Ziel der Dissertation war deshalb eine detaillierte genetische Untersuchung der NTRs hinsichtlich ihrer Bedeutung für die RNA-Translation und -Replikation. In die Analyse mit einbezogen wurden auch RNA-Strukturen innerhalb der kodierenden Region, die zwischen verschiedenen HCV-Genotypen hoch konserviert sind und die mit verschiedenen computer-basierten Modellen vorhergesagt wurden. Zur Kartierung der für RNA-Replikation benötigten Minimallänge der 5’ NTR wurde eine Reihe von Chimären hergestellt, in denen unterschiedlich lange Bereiche der HCV 5’ NTR 3’ terminal mit der IRES des Poliovirus fusioniert wurden. Mit diesem Ansatz konnten wir zeigen, dass die ersten 120 Nukleotide der HCV 5’ NTR als Minimaldomäne für Replikation ausreichen. Weiterhin ergab sich eine klare Korrelation zwischen der Länge der HCV 5’ NTR und der Replikationseffizienz. Mit steigender Länge der 5’ NTR nahm auch die Replikationseffizienz zu, die dann maximal war, wenn das vollständige 5’ Element mit der Poliovirus-IRES fusioniert wurde. Die hier gefundene Kopplung von Translation und Replikation in der HCV 5’ NTR könnte auf einen Mechanismus zur Regulation beider Funktionen hindeuten. Es konnte allerdings noch nicht geklärt werden, welche Bereiche innerhalb der Grenzen des IRES-Elements genau für die RNA-Replikation benötigt werden. Untersuchungen im Bereich der 3’ NTR ergaben, dass die variable Region für die Replikation entbehrlich, die X-Sequenz jedoch essentiell ist. Der polyU/UC-Bereich musste eine Länge von mindestens 11-30 Uridinen besitzen, wobei maximale Replikation ab einer Länge von 30-50 Uridinen beobachtet wurde. Die Addition von heterologen Sequenzen an das 3’ Ende der HCV-RNA führte zu einer starken Reduktion der Replikation. In den hier durchgeführten Untersuchungen zeigte keines der Elemente in der 3’ NTR einen signifikanten Einfluss auf die Translation. Ein weiteres cis aktives RNA-Element wurde im 3’ kodierenden Bereich für das NS5B Protein beschrieben. Wir fanden, dass Veränderungen dieser Struktur durch stille Punktmutationen die Replikation hemmten, welche durch die Insertion einer intakten Version dieses RNA-Elements in die variable Region der 3’ NTR wieder hergestellt werden konnte. Dieser Versuchsansatz erlaubte die genaue Untersuchung der für die Replikation kritischen Strukturelemente. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die Struktur und die Primärsequenz der Loopbereiche essentiell sind. Darüber hinaus wurde eine Sequenzkomplementarität zwischen dem Element in der NS5B-kodierenden Region und einem RNA-Bereich in der X-Sequenz der 3’ NTR gefunden, die eine sog. „kissing loop“ Interaktion eingehen kann. Mit Hilfe von gezielten Mutationen konnten wir zeigen, dass diese RNA:RNA Interaktion zumindest transient stattfindet und für die Replikation des HCV essentiell ist.

Modulation der Immunogenität von humanen Nierenzellkarzinomzellen durch stabilen TAP1-Gentransfer

Bei Nierenzellkarzinomen (NZK), wie auch bei vielen anderen Tumoren konnte eine reduzierte Expression der Klasse I Haupthistokompatibilitäts-Komplexe (MHC Klasse I) nachgewiesen werden, die assoziiert sein kann mit der gestörten Expression oder Funktion von Komponenten der Antigenprozessierung. Eine verminderte Erkennung solcher Tumore durch zytotoxische T-Lymphozyten und ein Zusammenhang mit einem Fortschreiten der Erkrankung führte zu der Annahme, daß es sich bei diesen Störungen um "immune escape"-Mechanismen handelt. Um die Bedeutung des heterodimeren Peptidtransporters TAP ("transporter associated with antigen processing") für die Immunogenität von Nierenzellkarzinomen zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals der stabile Gentransfer des humanen TAP1A-Gens in Nierenzellkarzinom-Zellen erfolgreich durchgeführt.
Dies konnte durch die Optimierung der Transfektionsmethode und des verwendeten Plasmid-Vektors erreicht werden. Die Transfektionen wurden mit Hilfe der Rechteck-Impuls-Elektroporation unter spezifischen, in der Arbeit etablierten Bedingungen durchgeführt. Der CMV-regulierte TAP-Expressions-Vektor wurde dahingehend verbessert, daß durch die Einführung einer IRES ("internal ribosomal entry site") Sequenz eine bicistronische m-RNS transkribiert wird, die sowohl das TAP1-Transgen als auch den Neomycin-Selektionsmarker enthält.
Es konnte nach klonaler Selektion eine stabile, aber unter den sieben getesteten Klonen heterogene Transkription der transgenen TAP1-mRNS nachgewiesen werden. In der Protein-Expression zeigten 5/7 der TAP1A-positive Klone eine mindestens zweifache Induktion der TAP1-Expression. In 2/7 dieser TAP1A-positive Klone war die TAP1-Überexpression mit einer Erhöhung der MHC Klasse I-Expression und selektiver Induktion des HLA-A2-Moleküls in der Durchflußzytometrie verbunden. Eine Quantifizierung des Peptidtransportes ergab je nach verwendetem Modellpeptid eine geringe oder gar keine Erhöhung der Transportrate in den TAP1-Transfektanden gegenüber Kontrollzellen. Ebenfalls konnte in Zytotoxizitäts-Analysen mit einer autologen T-Zellinie eine Erhöhung der spezifischen Lyse nicht gezeigt werden. Jedoch wurden im Zellkultur-Überstand dieser Zytotoxizitäts-Analysen bei einigen TAP1A-positive Transfektanden gegenüber mock transfizierten-Kontrollzellen deutlich erhöhte Werte des Tumornekrose-Faktor-alpha (TNF-alpha) gemessen, was als Maß einer T-Zell-Aktivierung gilt. Diese Ergebnisse sind konsistent mit einer ebenfalls deutlich gesteigerten T-Zell-Proliferation in Anwesenheit von TAP1A-positive Transfektanden.
Die alleinige stabile Überexpression von TAP1 in Nierenzellkarzinomzellen kann somit zu einer Modulation der MHC Klasse I-Expression und der T-Zell-Reaktivität führen. Das weist darauf hin, daß eine starke, konstitutive TAP1-Expression eine grundlegende Voraussetzung für eine effiziente Antigenprozessierung und Immunantwort darstellt und die Immuntoleranz gegenüber NZK durch stabilen TAP1-Gentransfer beinflußbar ist. Eine denkbare klinische Anwendung dieser Technik ist die Herstellung einer Tumorantigen-präsentierenden Zellvakzine, die eine T-Zell-Anergie gegenüber NZK durchbrechen könnte.
Schlüsselwörter: TAP, MHC, Antigenprozessierung, Tumorimmunologie, Gentransfer

Reinigung und Coexpression von Enzymen der Raubasin-Biosynthese

Die vorgestellten Arbeiten bezüglich der Biosynthese von pflanzlichen Indolalkaloiden können in einen molekularbiologischen und einen proteinche-mischen Teil aufgegliedert werden. Im molekularbiologischen Abschnitt stand die Entwicklung eines Vektorsystems im Vordergrund, das die gleichzeitige Expression mehrerer Enzyme in bakteriellen Kulturen erlaubte. Hierfür konnte zunächst die cDNA der Strictosidin-Synthase aus Rauvolfia serpentina in den Expressionsvektor pQE-70 einkloniert und das Protein aktiv exprimiert werden. Bevor es zum Einbau des Strictosidin-β-D-Glucosidase-Gens –ebenfalls aus Rauvolfia serpentina– kam, musste dessen Aktivität mit einer vorgeschalteten Ribosomenbindestelle sichergestellt werden. Diese zusätzliche Binderegion wurde an das 5’-Ende der cDNA angefügt, um die ungestörte Expression des Enzyms im späteren Coexpressions-System zu gewährleisten. Im Hinblick auf weiterführende Arbeiten in Bezug auf die komplette in vitro-Synthese bereits bekannter Alkaloide, wie z.B. das antiarrhythmisch wirkende Ajmalin oder das antihypertensiv wirkende Heteroyohimbin-Alkaloid Raubasin, wurde die ursprüngliche multiple-clonig-site des verwendeten Expressionsvektors pQE-70 um 27 zusätzliche Restriktionsschnittstellen (verteilt auf 253 bp) erweitert. Nach erfolgreicher Ligation der Strictosidin-β-D-Glucosidase-cDNA mit vorgeschalteter Ribosomenbindestelle an das 3’-Ende des Strictosidin-Synthase-Gens gelang die heterologe Coexpression beider Enzyme in einer homogenen Suspensionskultur des E. coli-Expressionsstamms M15. Dafür wurde das Vektorkonstrukt pQE-70bh-STR-RBS-SG entwickelt. Das Endprodukt der anschließenden enzymatischen Umsetzung von Tryptamin und Secologanin wurde über das Zwischenrodukt Strictosidin gebildet und konnte als Cathenamin identifiziert werden. Im proteinchemischen Teil der Dissertation wurde die Reinigung einer Cathenamin-Reduktase aus Zellsuspensionskulturen von Catharanthus roseus RC mit dem Ziel der partiellen Bestimmung der Aminosäuresequenz bearbeitet. Das gesuchte Enzym wandelte in einer NADPH-abhängigen Reaktion das Edukt Cathenamin in Raubasin um. Des weiteren wurde untersucht, wie viele Enzyme insgesamt an der Umwandlung von Cathenamin zu Raubasin und den eng verwandten Produkten Tetrahydroalstonin und 19-Epi-Raubasin beteiligt waren. Unter Anwendung eines hierfür entwickelten säulenchromatographischen Protokolls gelang die Reinigung einer Raubasin-bildenden Reduktase, deren Teilsequenz jedoch noch nicht bestimmt werden konnte. Die Anzahl der beteiligten Enzyme bei der Ausbildung von Raubasin, Tetrahydroalstonin und 19-Epi-Raubasin konnte auf mindestens zwei beziffert werden.

Transformation von Osteospermum ecklonis mit Konstrukten zur Induktion von Virusresistenz und Blühverfrühung

Für die Etablierung einer Transformationsmethode züchterisch relevanter Sorten von Osteospermum ecklonis (Kapmargerite) wurde zunächst ein geeignetes Protokoll für die Regeneration adventiver Sprosse aus vegetativem Gewebe entwickelt. Anschließend wurden Transformationen von Markergenen durch Kokultur mit Agrobacterium tumefaciens durchgeführt. Hierzu wurden Konstrukte verwendet, die das Gen für ß-D-Glucuronidase (GUS) enthielten und deren Expression in transgenen Pflanzen histochemisch nachgewiesen werden konnte. Kanamycinresistenz erwies sich als geeigneter Selektionsmarker für die Transformation. Es konnten von verschiedenen O. ecklonis Sorten GUS-transgene, nicht-chimäre Pflanzen regeneriert werden.Zur Erzeugung transgener Pflanzen mit dem Ziel der Resistenz gegen LMV (lettuce mosaic potyvirus, Salat Mosaik Virus) wurden drei Konstrukte verwendet. Das erste enthält die kodierende Sequenz der Virusproteine VPg, Pro und 6K2. Durch PCR-Mutation wurde die Proteinase-Schnittstelle zwischen 6K2 und VPg zerstört, sowie Start- und Stopcodon eingeführt. Die anderen LMV-abgeleiteten Konstrukte enthalten nicht translatierbare Fragmente des coat protein Gens in sense und antisense Orientierung.Außerdem wurde O. ecklonis noch mit dem Gen des mutmaßlichen Transkriptionsfaktor SPL3 aus Arabidopsis thaliana unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors transformiert. SPL3 ist an der Regulierung der Blüteninduktion in A. thaliana beteiligt.Regenerierte O. ecklonis wurden durch PCR mit konstruktspezifischen Primern auf Anwesenheit des Transgens und Kontamination durch A. tumefaciens überprüft.